Cayman LipiDOT Strips™: nowe narzędzie do badania interakcji białko-lipid

13 Marca 2024 (Ostatnia aktualizacja 25.10.2024)

Interakcje między białkami i lipidami odgrywają różnorodne i złożone role w wielu procesach biologicznych, począwszy od struktury, funkcji i dynamiki błon biologicznych po interakcje gospodarz-patogen, metabolizm, transport i lokalizację oraz sygnalizację komórkową. 1-3 Podobnie jak w przypadku bardziej hydrofilowych ligandów, wiele białek ma miejsca wiązania lipidów i może z nimi specyficznie oddziaływać, modyfikując strukturę, konformację i składanie białek, wpływając na ich rekrutację, lokalizację i aktywację. 1,4,5 Interakcje białko-lipid scharakteryzowano jedynie dla niewielkiej liczby białek, jednak prawdopodobnie istnieje wiele innych białek wiążących lipidy, które nie zostały jeszcze odkryte. 1
Lepsze zrozumienie ważnej roli lipidów w modulowaniu funkcji białek poprzez identyfikację nowych interakcji lipid-białko może być przydatne w poszukiwaniu nowych możliwości terapeutycznych.

Praca z Cayman LipiDOT Strips™

Paski Cayman LipiDOT™ służą do identyfikacji potencjalnych interakcji między docelowym białkiem, a 22 różnymi lipidami ułożonymi w formie wstępnie skonfigurowanego panelu. Przebieg pracy jest pod wieloma względami podobny do metody Western Blot. Test jest prosty w wykonaniu, tani i możliwy do przeprowadzenia w ciągu jednego dnia.
Paski Cayman LipiDOT™ blokuje się buforem blokującym i inkubuje z oczyszczonym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Kolejno dodaje się przeciwciała skierowane przeciwko natywnemu białku lub odpowiedni znacznik powinowactwa, a następnie drugorzędowe przeciwciało niosące enzym reporterowy, aby umożliwić detekcję przy użyciu substratów chemiluminescencyjnych, fluorescencyjnych lub chromogennych. Wyniki testu wizualizuje się za pomocą standardowego sprzętu do obrazowania w oparciu o wybrany odczynnik detekcyjny.

Rysunek 1. Paski Cayman LipiDOT™ umożliwiają detekcję przy użyciu białek natywnych lub białek ze znacznikiem epitopowym w połączeniu ze znakowanymi przeciwciałami pierwotnych lub wtórnych. W powyższym przykładzie użyto peroksydazę chrzanową (HRP), która wymaga dodania odpowiedniego substratu i detekcji przy odpowiedniej długości fali.


Paski Cayman LipiDOT™ zawierają biologicznie istotne lipidy w tym fosfolipidy, cholesterol, a także diglicerydy i niektóre sfingolipidy.



Fosfolipidy błonowe są znane ze swojej roli głównego składnika błon, w których tworzą dwuwarstwę lipidową ze względu na swój amfipatyczny charakter. 6-9 Oprócz cholesterolu, głównego sterolowego składnika błon komórkowych ssaków, który oddziałuje z fosfolipidami błonowymi, lipidy oddziałują z białkami, wpływając na ich zachowanie.
Fosfatydyloinozytole (PI, znane również w literaturze jako PtdIns) to klasa fosfolipidów błonowych, które mogą ulegać fosforylacji w różnych pozycjach pierścienia inozytolu z wytworzeniem różnych fosforanów fosfatydyloinozytolu (PIP), rodziny lipidów błonowych, które działają jako kluczowe cząsteczki sygnalizacji komórkowej. 10 PIP uczestniczą w wielu reakcjach komórkowych, pełniąc funkcję markerów lokalizacji, analogicznie do biochemicznych kodów pocztowych, organizując białka komórkowe w określone miejsca i kierując ich działaniem poprzez specyficzne interakcje białko-lipid. PIP mogą również działać jako prekursory innych wtórnych przekaźników, jak w przypadku PIP2, który jest hydrolizowany przez fosfolipazę C z wytworzeniem IP3 i diacyloglicerolu (DAG). Cząsteczki DAG pełnią rolę wtórnych przekaźników i rekrutują do błon komórkowych kinazę białkową C (PKC), kluczową rodzinę enzymów odgrywającą rolę w wielu szlakach sygnałowych.


Inne lipidy błonowe można również przekształcić w lipidowe cząsteczki sygnalizacyjne, które kontrolują szereg dalszych reakcji, takich jak migracja, proliferacja i przeżycie komórek. 11,12 Lizoglicerofosfolipidy, w tym kwas lizofosfatydowy (LPA), lizofosfatydylocholina (LPC) lub lizofosfatydyloetanoloamina (LPE) powstają w wyniku katalizowanej przez PLA2 hydrolizy fosfolipidów błonowych. Bioaktywny sfingolipidowy sfingozyno-1-fosforan (S1P) jest strukturalnie podobny do LPA i może być również wytwarzany na błonach w wyniku hydrolizy sfingomieliny (SM), co powoduje uwolnienie aminoalkoholowej sfingozyny, która może być następnie fosforylowana przez kinazę sfingozynową co prowadzi do uzyskania S1P.

Paski Cayman LipiDOT™ - PIP Plus zawierają także sulfatyd i kardiolipinę (CL). Sulfatyd to siarczanowany glikosfingolipid, który odgrywa znaczącą rolę w układzie nerwowym. Występuje w dużych ilościach w osłonce mielinowej, bogatym w lipidy przedłużeniu błony komórkowej, który chroni aksony i pomaga w przekazywaniu impulsów elektrycznych między neuronami. 14 CL jest fosfolipidem i głównym składnikiem lipidowym wewnętrznej błony mitochondrialnej, odgrywającym rolę w bioenergetyce i dynamice mitochondriów. 15
Większość lipidów znajdujących się w paskach Cayman LipiDOT™ jest dostępna w sprzedaży jako osobne produkty. Narzędzia te są nieocenione w metodach uzupełniających Cayman LipiDOT Strips™, takich jak testy współsedymentacji i wspólnej flotacji liposomów. 9,13

Warto również zwrócić uwagę na znane białka wiążące lipidy, które można stosować jako kontrole pozytywne po inkubacji z oddzielnymi paskami Cayman LipiDOT™ wykonywanymi równolegle lub nakrapianymi na niebieskich pustych polach w ramach pojedynczego eksperymentu Cayman LipiDOT Strips™.

Białka, które mogą być przydatne jako kontrole pozytywne:
⦁ Białko wiążące PtdIns-(4,5)-P 2 – nr katalogowy 10009815
⦁ Białko wiążące PtdIns-(3,4,5)-P 3 – nr katalogowy 10009817
⦁ Aneksyna V (ludzka, rekombinowana) – nr katalogowy 20594

Bibliografia

1. Sych, T., Levental, KR i Sezgin, E. Interakcje lipid-białko w organizacji i funkcjonowaniu błony komórkowej. Annu. Ks. Biofizyka. 51, 135-156 (2022).
2. Corradi, V., Mendez-Villuendas, E., Ingόlfsson, HI i in. Interakcje lipid-białko są unikalnymi odciskami palców dla białek błonowych. Centrum ACS. Nauka. 4(6) , 709-717 (2018).
3. Zhao, H. i Lappalainen, P. Prosty przewodnik po biochemicznych podejściach do analizy interakcji białko-lipid. Mol. Biol. Komórka 23(15) , 2823-2830 (2012).
4. Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. i Dowhan, W. Lipidy w składaniu białek błonowych i organizacji superkompleksów białkowych: implikacje dla zaburzeń związanych z lipidami. Podkomórka. Biochemia . 49 , 197-239 (2008).
5. Dowler, S., Kular, G. i Alessi, DR. Test nakładania lipidów białkowych. Nauka. STKE 129 , PI6 (2002).
6. Escribá, PV, González-Ros, JM, Goñi, FM i in . Błony: miejsce spotkań lipidów, białek i terapii. J. Cell. Mol. Med. 12(3) , 829-875 (2008).
7. Casares, D., Escribá, PV i Rossellό, CA Skład lipidów błonowych: wpływ na strukturę, funkcję i przedziały błon i organelli oraz możliwości terapeutyczne. Wewnętrzne J. Mol. Nauka. 20(9) , 2167 (2019).
8. van Meer, G., Voelker, DR i Feigenson, GW Lipidy błonowe: gdzie są i jak się zachowują. Nat. Wielebny Mol. Biol Komórkowy. 9(2) , 112-124 (2009).
9. Saliba, AE., Vonkova, I. i Gavin, A.-C. Systematyczna analiza interakcji białko-lipidy nabiera tempa. Nat. Wielebny Mol. Biol Komórkowy . 16(12) , 753-761 (2015).
10. Dickson, EJ i Hille, B. Zrozumienie fosfoinozytydów: rzadkie, dynamiczne i niezbędne fosfolipidy błonowe. Biochemia. J. 476(1) , 1-23 (2019).
11. Kano, K., Aoki, J. i Hla, T. Mediatory lizofosfolipidowe w zdrowiu i chorobie. Annu. Wielebny Pathol. 17 , 459-483 (2022).
12. zu Heringdorf, DM i Jakobs, KH Receptory lizofosfolipidowe: sygnalizacja, farmakologia i regulacja przez metabolizm lizofosfolipidów. Biochim. Biofizyka. Akta. 1768(4) , 923-940 (2007).
13. Senju, Y., Lappalainen, P. i Zhao, H. Liposomowe testy współsedymentacji i wspólnej flotacji w celu badania interakcji lipid-białko. Metody Mol. Biol . 2251 , 195-204 (2021).
14. Barnes-Vélez, JA, Aksoy Yasar FB i Hu, J. Mielinowy metabolizm lipidów i jego rola w mielinizacji i utrzymaniu mieliny. Innowacja (Camb) . 4(1) :100360 (2022).
15. Falabella, M., Vernon, HJ, Hanna, MG i in . Kardiolipina, mitochondria i choroby neurologiczne. Trendy Endokrynol. Metab. 32(4) :224-237 (2021).

 

To może Cię zainteresować...

LogPhase – czytnik dla mikrobiologa
LogPhase – czytnik dla mikrobiologa

LogPhase – czytnik dla mikrobiologa

Wykorzystanie mikroorganizmów leży u podstaw przemysłu biotechnologicznego. Niezależnie od tego czy mowa jest o produkcji żywności, leków, alternatywnych tworzyw syntetycznych czy biopaliw, to niezbędne jest badanie tempa i charakterystyki wzrostu drobnoustrojów.

CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA
CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA

CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA

Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna zostały w 2020 roku uhonorowane Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii za rozwój metody CRISPR/Cas9, nazywanej potocznie precyzyjnymi nożyczkami genetycznymi. Należy jednak pamiętać, że zainteresowanie wielu badaczy oraz jednostek naukowych na całym Świecie tym niezwykle precyzyjny narzędziem do edycji genów sięga późnych lat 80 tych XX wieku.

In-Fusion® prawdziwy kombajn w Twoim Laboratorium!
In-Fusion® prawdziwy kombajn w Twoim Laboratorium!

In-Fusion® prawdziwy kombajn w Twoim Laboratorium!

Prężny rozwój technik genetyki, biofizyki i biochemii przypadający na lata 70 XX w., pozwolił na powstaje nowej dyscypliny badawczej zwanej biologią molekularną. Jedną z technik, która zrewolucjonizowała pracę z materiałem genetycznym była opracowana w 1973 roku pierwsza metoda łączenia sek...

Zobacz wszystkie