Nowa generacja odwrotnej transkrypcji
12 Grudnia 2019 (Ostatnia aktualizacja 22.10.2024)
Wydajna synteza cDNA: odwrotna transkryptaza PrimeScript
Odwrotna transkryptaza PrimeScript ma wyjątkowo silną aktywność wypierania nici i umożliwia wydajną syntezę cDNA do 12 kb długości. Jest to RTaza mocna, wszechstronna i idealnie nadająca się do zastosowań wymagających cDNA o pełnej długości, na przykład tworzenia bibliotek cDNA i innych technik obejmujących syntezę pierwszej nici cDNA ( RT-PCR, przygotowywanie sond cDNA, real-time RT-PCR). PrimeScript RTaza może być wykorzystywana do przeprowadzania reakcji odwrotnej transkrypcji z każdej matrycy RNA, tym bogatych w GC i matryc RNA o złożonej strukturze drugorzędowej. Enzym ten to zmodyfikowana zrekombinowana RTaza MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) o potwierdzonym braku aktywności RNazy H. Ze względu na doskonałą zdolność wydłużania odwrotnej transkryptazy PrimeScript, syntezę cDNA można przeprowadzić w niższej temperaturze (42°C), zmniejszając ryzyko degradacji RNA, która może wystąpić podczas konwencjonalnych reakcji prowadzonych w wysokich temperaturach.
Opublikowano ponad 3700 artykułów, w których odwrotna transkryptaza PrimeScript została wymieniony w różnorodnych zastosowaniach naukowych, takich jak ekspresja genów, odkrywanie genów, analiza ekspresji i regulacji miRNA, analiza transkryptomu, ewolucja molekularna, wirusologia i mikrobiologia.
Cechy:
- Silna aktywność wypierania nici oraz zdolność wydłużania: możliwość syntezy długich cząsteczek cDNA pełnej długości (aż do 12 kb)
- Synteza cDNA w 42°C daje niższe tło i wyższą wydajność cDNA ponieważ niższa temperatura chroni przed degradacją RNA
Synteza cDNA z niskim tłem, wspaniałym wydłużaniem oraz wysoką wydajnością w 42°C przez odwrotną transkryptazę PrimeScript w porównaniu z sześcioma innymi dostępnymi komercyjnie RTazami. Marker RNA (1 kb, 2 kb, 4.4 kb, 6.4 kb, 8.4 kb, 10 kb oraz 12 kb) został użyty jako matryca do syntezy 1-szej nici cDNA. Reakcje przeprowadzono w 42°C zgodnie z zaleceniami każdego producenta. Równoważne objętości reakcji były analizowane elektroforezą w warunkach denaturujących a produkty były barwione SYBR Green II i analizowane obrazowaniem fluorescencji. Reakcje przeprowadzone RTazą PrimeScript wykazały najwyższą wydajność syntezy cDNA o pełnej długości i najniższe tło.
- Najwyższa dokładność: najniższa częstość błędów pośród przetestowanych pięciu dostępnych komercyjnie odwrotnych transkryptaz
Odwrotna transkrypcja z najwyższą dokładnością dzięki RTazie PrimeScript. Reakcja syntezy pierwszej nici cDNA została przeprowadzona RTazą PrimeScript lub inną komercyjnie dostępną. Matrycą dla wszystkich reakcji było Całkowite RNA z Ludzkiego Łożyska (Clontech). We wszystkich reakcjach wykorzystano startery oligo-dT i przeporowadzono je zgodnie z zaleceniami każdego producenta. Po syntezie cDNA przeprowadzono reakcję PCR z polimerazą najwyższej dokładności PrimeSTAR HS (gen: TF, amplikon: 500 bp). W reakcji kontrolnej przeprowadzono tylko PCR (bez odwrotnej transkrypcji). Amplikony zostały sklonowane i dla każdej reakcji zsekwencjonowano wiele klonów. Częstość błędu została wyrażona jako ilość błędów na całkowitą ilość zasad zsekwencjonowanych dla każdej reakcji (~200 000 zasad). Z zaledwie 7 błędami na 201 297 zasad (częstość błędu 0,0035%), RTaza PrimeScript wykazała najwyższą dokładność wśród testowanych RTaz.
- Działa na wymagających matrycach: doskonałe wyniki nawet na matrycach bogatych w pary GC oraz o złożonej strukturze drugorzędowej
cDNA o długości 418 bp zostało zsyntetyzowane na matrycy charakteryzującego się złożoną strukturą drugorzędową i wysoką zawartością par GC (70,6%) 28S rybosomalnego RNA za pomocą RTazy PrimeScript lub innej komercyjnie dostępnej. Matrycą było całkowite RNA z komórek HL60 z wykorzystaniem starterów specyficznych dla genu. Reakcja dla PrimeScript została przeprowadzona w 42°C, natomiast dla RTazy Firmy C w 50°C lub 55°C zgodnie z zaleceniami producenta. Wydajność syntezy cDNA sprawdzono reakcją PCR. RTaza PrimeScript wykazała wyższą czułość i wydajność transkrypcji.
- Łatwość użycia: niska częstość niespecyficznego annealingu, nawet na niecałkowicie zdenaturowanym RNA
- Najwyższa czułość: użyj mniej Twojej bezcennej próbki RNA
- Synteza zakończona powodzeniem nawet dla reakcji trwającej 30 min. (60 min dla dłuższych transkryptów)
