Nowa generacja odwrotnej transkrypcji

12 Grudnia 2019 (Ostatnia aktualizacja 22.10.2024)

Wydajna synteza cDNA: odwrotna transkryptaza PrimeScript

Odwrotna transkryptaza PrimeScript ma wyjątkowo silną aktywność wypierania nici i umożliwia wydajną syntezę cDNA do 12 kb długości. Jest to RTaza mocna, wszechstronna i idealnie nadająca się do zastosowań wymagających cDNA o pełnej długości, na przykład tworzenia bibliotek cDNA i innych technik obejmujących syntezę pierwszej nici cDNA ( RT-PCR, przygotowywanie sond cDNA, real-time RT-PCR). PrimeScript RTaza może być wykorzystywana do przeprowadzania reakcji odwrotnej transkrypcji z każdej matrycy RNA, tym bogatych w GC i matryc RNA o złożonej strukturze drugorzędowej. Enzym ten to zmodyfikowana zrekombinowana RTaza MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) o potwierdzonym braku aktywności RNazy H. Ze względu na doskonałą zdolność wydłużania odwrotnej transkryptazy PrimeScript, syntezę cDNA można przeprowadzić w niższej temperaturze (42°C), zmniejszając ryzyko degradacji RNA, która może wystąpić podczas konwencjonalnych reakcji prowadzonych w wysokich temperaturach.

Opublikowano ponad 3700 artykułów, w których odwrotna transkryptaza PrimeScript została wymieniony w różnorodnych zastosowaniach naukowych, takich jak ekspresja genów, odkrywanie genów, analiza ekspresji i regulacji miRNA, analiza transkryptomu, ewolucja molekularna, wirusologia i mikrobiologia.

Cechy:

  • Silna aktywność wypierania nici oraz zdolność wydłużania: możliwość syntezy długich cząsteczek cDNA pełnej długości (aż do 12 kb) 
  • Synteza cDNA w 42°C daje niższe tło i wyższą wydajność cDNA ponieważ niższa temperatura chroni przed degradacją RNA

 

Synteza cDNA z niskim tłem, wspaniałym wydłużaniem oraz wysoką wydajnością w 42°C przez odwrotną transkryptazę PrimeScript w porównaniu z sześcioma innymi dostępnymi komercyjnie RTazami. Marker RNA (1 kb, 2 kb, 4.4 kb, 6.4 kb, 8.4 kb, 10 kb oraz 12 kb) został użyty jako matryca do syntezy 1-szej nici cDNA. Reakcje przeprowadzono w 42°C zgodnie z zaleceniami każdego producenta. Równoważne objętości reakcji były analizowane elektroforezą w warunkach denaturujących a produkty były barwione SYBR Green II i analizowane obrazowaniem fluorescencji. Reakcje przeprowadzone RTazą PrimeScript wykazały najwyższą wydajność syntezy cDNA o pełnej długości i najniższe tło.

  • Najwyższa dokładność: najniższa częstość błędów pośród przetestowanych pięciu dostępnych komercyjnie odwrotnych transkryptaz

Odwrotna transkrypcja z najwyższą dokładnością dzięki RTazie PrimeScript. Reakcja syntezy pierwszej nici cDNA została przeprowadzona RTazą PrimeScript lub inną komercyjnie dostępną. Matrycą dla wszystkich reakcji było Całkowite RNA z Ludzkiego Łożyska (Clontech). We wszystkich reakcjach wykorzystano startery oligo-dT i przeporowadzono je zgodnie z zaleceniami każdego producenta. Po syntezie cDNA przeprowadzono reakcję PCR z polimerazą najwyższej dokładności PrimeSTAR HS (gen: TF, amplikon: 500 bp). W reakcji kontrolnej przeprowadzono tylko PCR (bez odwrotnej transkrypcji). Amplikony zostały sklonowane i dla każdej reakcji zsekwencjonowano wiele klonów. Częstość błędu została wyrażona jako ilość błędów na całkowitą ilość zasad zsekwencjonowanych dla każdej reakcji (~200 000 zasad). Z zaledwie 7 błędami na 201 297 zasad (częstość błędu 0,0035%), RTaza PrimeScript wykazała najwyższą dokładność wśród testowanych RTaz.

  • Działa na wymagających matrycach: doskonałe wyniki nawet na matrycach bogatych w pary GC oraz o złożonej strukturze drugorzędowej

 

cDNA o długości 418 bp zostało zsyntetyzowane na matrycy charakteryzującego się złożoną strukturą drugorzędową i wysoką zawartością par GC (70,6%) 28S rybosomalnego RNA za pomocą RTazy PrimeScript lub innej komercyjnie dostępnej. Matrycą było całkowite RNA z komórek HL60 z wykorzystaniem starterów specyficznych dla genu. Reakcja dla PrimeScript została przeprowadzona w 42°C, natomiast dla RTazy Firmy C w 50°C lub 55°C zgodnie z zaleceniami producenta. Wydajność syntezy cDNA sprawdzono reakcją PCR. RTaza PrimeScript wykazała wyższą czułość i wydajność transkrypcji.

  • Łatwość użycia: niska częstość niespecyficznego annealingu, nawet na niecałkowicie zdenaturowanym RNA
  • Najwyższa czułość: użyj mniej Twojej bezcennej próbki RNA
  • Synteza zakończona powodzeniem nawet dla reakcji trwającej 30 min. (60 min dla dłuższych transkryptów)
 

To może Cię zainteresować...

LogPhase – czytnik dla mikrobiologa
LogPhase – czytnik dla mikrobiologa

LogPhase – czytnik dla mikrobiologa

Wykorzystanie mikroorganizmów leży u podstaw przemysłu biotechnologicznego. Niezależnie od tego czy mowa jest o produkcji żywności, leków, alternatywnych tworzyw syntetycznych czy biopaliw, to niezbędne jest badanie tempa i charakterystyki wzrostu drobnoustrojów.

CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA
CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA

CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA

Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna zostały w 2020 roku uhonorowane Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii za rozwój metody CRISPR/Cas9, nazywanej potocznie precyzyjnymi nożyczkami genetycznymi. Należy jednak pamiętać, że zainteresowanie wielu badaczy oraz jednostek naukowych na całym Świecie tym niezwykle precyzyjny narzędziem do edycji genów sięga późnych lat 80 tych XX wieku.

In-Fusion® prawdziwy kombajn w Twoim Laboratorium!
In-Fusion® prawdziwy kombajn w Twoim Laboratorium!

In-Fusion® prawdziwy kombajn w Twoim Laboratorium!

Prężny rozwój technik genetyki, biofizyki i biochemii przypadający na lata 70 XX w., pozwolił na powstaje nowej dyscypliny badawczej zwanej biologią molekularną. Jedną z technik, która zrewolucjonizowała pracę z materiałem genetycznym była opracowana w 1973 roku pierwsza metoda łączenia sek...

Zobacz wszystkie