Metoda Real time PCR

Wśród wielu technik biologii molekularnej jedną z podstawowych jest PCR (Polymerase Chain Reaction, Reakcja Łańcuchowa Polimerazy) oraz jej odmiana ilościowa Real Time PCR (=qPCR). Ze względu na podobieństwo skrótów często mylona z rt qPCR od Reverse Transcription (Odwrotnej Transkrypcji).

Na czym polega metoda real time PCR?

Real time PCR to jeden z najnowocześniejszych oraz najdokładniejszych rodzajów pomiarów i analizy genetycznej. Pozwala na określenie liczby kopii matrycy DNA lub cDNA dzięki monitorowaniu przyrostu amplikonów aż do osiągnięcia ich określonego poziomu. Na tej podstawie odczytywany jest wynik w postaci numeru cyklu (Ct). Im mniej cykli potrzeba do osiągnięcia określonego poziomu sygnału, tym więcej kopii matrycy znajduje się w próbce.

Odczytywanie sygnału (fluorescencji) odbywa się po każdym cyklu, dlatego metodę określa się jako PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR). Technika jest niezwykle czuła i umożliwia wykrycie już nawet jednej kopii danego genu. Często oznaczanie próbek real time PCR wykonuje się jednocześnie z próbą referencyjną, a następnie do niej odnosi wyniki. Mówi się wtedy o analizie względnej/referencyjnej.

Znając liczbę kopii genu znajdującą się w próbie referencyjnej, możemy dokładnie określić konkretną liczbę w badanej próbce. Analiza referencyjna pozwala również na wprowadzenie standaryzacji pomiędzy próbkami, co znajduje zastosowanie zwłaszcza w rt-qPCR.

Czym różni się real time PCR od tradycyjnego badania PCR?

Metoda PCR w czasie rzeczywistym umożliwia dokładne określenie liczby kopii genu w analizowanej próbie, podczas gdy PCR z klasycznym rozdziałem na żelu (end point) pozwala jedynie na wykazanie obecności danego allelu lub jego braku. Ewentualnie analizy dużo lub mało. qPCR jest więc narzędziem bardziej ilościowym, zaś klasyczny PCR – jakościowym. Choć oczywiście istnieją inne bardziej specjalistyczne wykorzystania obydwu technik.

Ponadto różnią się platformy do przeprowadzania obydwu reakcji. O ile klasyczny PCR możemy przeprowadzić w termocyklerze do real time, o tyle pomiaru fluorescencji bez specjalnych detektorów nie zbierzemy. Jak zostało wcześniej zauważone, wynik klasycznego PCR analizuje się na żelu w obecności barwnika interkalującego pomiędzy nici np. bromku etydyny lub bezpieczniejszych alternatyw. Dodaje się ich podczas polimeryzacji żelu lub zanurza się żel po rozdziale elektroforetycznym w ich roztworze. W wyniku tego działania pod wpływem światła UV na żelu uwidaczniają się prążki, których masę możemy odczytać względem tzw. ,,drabinki”,  czyli wzorca mas (Ryc.1). 

Ryc.1 Wynik amplifikacji polimerazą EmeraldAmp w układzie end point PCR (rozdział na żelu).

W real time PCR możemy pracować albo z barwnikami fluorescencyjnymi np. SYBR (=TB Green) lub z sondami TaqMan. Zależnie od tego, co wybierzemy, różnić się będą premiksy do przeprowadzania reakcji. Jeśli wybierzemy premiks z SYBR możemy pracować z tymi samymi primerami co w klasycznym PCR, projektować je i zlecać syntezę (metoda nie wymaga dodatkowych modyfikacji). Sygnał z barwnika interkalującego pomiędzy nici zbieramy jest przez detektor podczas reakcji (Ryc.2).

Jeśli zaś chcemy pracować z sondami TaqMan konieczne jest zakupienie sond dedykowanych do analizy danego genu. Zawierają specjalne krótkie sekwencje skoniugowane z barwnikami fluorescencyjnymi. Najczęściej są to tandemy reporter-quencher (np. FAM/TAMRA), znajdujące się po jednym na skrajnych stronach oligonukleotydu. Wymagana jest także polimeraza z właściwościami egzonukleazy 5’->3’. Podczas syntezy enzym przecina sondę, separując od siebie elementy tandemu. W ten sposób po wzbudzeniu reportera nie dochodzi do przechwycenia sygnału przez quencher i może być on zebrany przez detektor w czasie rzeczywistym (Ryc.2). 

Ryc.2 Porównanie metod real time PCR.

Często do miksów do real time PCR dodawany jest także referencyjny barwnik fluorescencyjny np. ROX (np. w systemach Applied Biosystems), umożliwiający skontrolowanie warunków reakcji. Na przykład sprawdzenie, czy nie doszło do wyparowania mieszaniny reakcyjnej podczas nagrzewania. Sygnał barwnika referencyjnego powinien być taki sam we wszystkich dołkach.

Wynik analizy real time PCR po wyeksportowaniu otrzymujemy w postaci macierzy liczb programu excel. Najczęściej są to wartości Ct, czyli numery cykli, w których amplikony osiągnęły wyznaczone stężenie (Ryc.3). Następnie np. wg. równania
2^-ΔCt określana jest liczba kopii. Wewnętrzne algorytmy wbudowanych programów umożliwiają automatyczne przeprowadzenie analizy względem krzywej kalibracyjnej lub próby kalibracyjnej, jak również określenie wydajności reakcji czy specyficzności amplifikacji (po przeprowadzeniu krzywej topnienia) i innych.

Ryc. 3 Przykładowy wynik reakcji real time PCR w postaci krzywych.

Wybór polimerazy w technice real time PCR

Wspomniano już, że zależnie od układu, w jakim pracujemy (sondy Taq Man/ TB Green (SYBR)), polimeraza powinna mieć lub nie aktywność egzonukleazy 5’->3’. Co jednak z aktywnością tzw. “proof reading” , czyli egzonukleazy 3’->5’? Czy jest ona potrzebna?
Otóż biorąc pod uwagę, że metoda real time jest pomiarem ilościowym, warto zadbać, aby warunki przez nas zapewnione były najbardziej zbliżone do pełnej wydajności reakcji. Tylko wtedy zbliżymy się do określenia faktycznej liczby kopii. Tak więc należy zadbać o odpowiednie stężenia komponentów reakcji, temp. oraz by primery oddziaływały z wygenerowanymi amplikonami najefektywniej jak to możliwe. Czyli aby kopie matrycowe nie zawierały błędów przeszkadzających w odnalezieniu komplementarności. W tym pomoże polimeraza o właściwościach naprawczych, czyli “proof reading”.
Warto w tym miejscu wspomnieć, że efektywność reakcji zmniejszona zaledwie o 10% sprawia, że tracimy ponad 75% produktu (Tab.1)!

Tab 1. Przyrost amplikonów zależnie od wydajności reakcji PCR.

Polimerazy o takich właściwościach (Ex Taq i Advantage) znajdziecie w naszych premiksach do real time.

Zapraszamy do zakupu qPCR – Biokom

Wśród premiksów znajdziecie Państwo także ułatwiającą pracę Terrę do przeprowadzania qPCR bez izolacji DNA – Terra – Biokom