qPCR
| Aplikacja | Rutynowe analizy | Genotypowanie | Genotypowanie, wydajny PCR | Kłopotliwe primery | Specjalna kontrola czystości pracy |
| Rekomendacja | Terra qPCR Direct TB Green Premix | TB Green Advantage qPCR Premix | Premix Ex Taq (Perfect Real Time) | TB Green Premix DimerEraser | Probe qPCR Mix, with UNG |
| Cecha | Szybki protokół, rutynowe użycie | Kłopotliwe matryce oraz bogate w GC | Doskonały do rt-qPCR | Eliminacja niespecyficznych produktów | Eliminacja ryzyka kontaminacji amplikonami z poprzednich reakcji PCR |
| Wielkość amplikonu | |||||
| Matryca | <3 kb | ~300 bp | <300 bp I <570 bp | <300 bp | ~300 bp |
| Aktywność | |||||
| 5’-3’ ekgzonukleazy | Tak | Tak | Tak | Tak | Tak |
| 3’-5’ ekgzonukleazy | Tak | Tak | Tak | ||
| Generowane końce | T/A | T/A | T/A | T/A | T/A |
| Matryce bogate w GC | 70% | 90% | Tak | Tak | |
| Formaty produktu | |||||
| Sposób detekcji(SYBR= TB Green) | TB Green | SYBR | TB Green/sondy | TB Green | sondy |
| Premiks (2x) | Tak | Tak | Tak | Tak | Tak |
| kontrola ROX | Tak | Tak | Tak | Tak | Tak |
| Hot Start | Tak | Tak | Tak | Tak | Tak |
Terra to linia niezwykłych produktów umożliwiających genotypowanie DNA bezpośrednio z próbki. Dzięki zastosowaniu niezwykłej polimerazy odpornej na inhibitory reakcji PCR udało się uprościć proces analizy oraz nie wymaga on ściśle kontrolowanych warunków i wyizolowanej matrycy. Wysoka czułość enzymu z kolei pozwala na pracę z DNA uwolnionym podczas lizy termicznej bezpośrednio z komórek. Polimeraza Terra amplifikuje odcinki do 2 kb. Fragmenty bogate w GC (70%) nie stanowią problemu co czyni ją świetnym narzędziem zarówno w bardziej wymagających aplikacjach jak i rutynowej, szybkiej analizie wyizolowanego DNA.
Terra PCR direct umożliwia:
– znaczne przyspieszenie protokołu reakcyjnego i łatwość analizy poprzez całkowitą eliminację etapu izolacji DNA
– pracę z trudnymi i niskokopijnymi matrycami
– specyficzną reakcje amplifikacji dzięki zaopatrzeniu w Hot Start
– powielanie matryc bogatych w GC (70%, 2 kb)
Zachęcamy do zapoznania się z broszurą.
Formaty I aplikacje zestawów.
Strona produktu -> Terra qPCR Direct TB Green Premix (takarabio.com)
Real-time PCR with crude extracts—Terra qPCR Direct TB Green Premix versus a conventional 2X qPCR premix. Real-time PCR was performed using undiluted, 4X diluted, and 16X diluted crude alkaline-heat extracts of mouse spleen or cow muscle (beef foodstuff), and either Terra qPCR Direct TB Green Premix or a conventional qPCR premix. Using the manufacturer’s recommended conditions for each enzyme mix, a 165 bp region of the beta-globin gene Hbb-b1 was amplified from the mouse spleen extract (Panel A), and a 289 bp region of the cytochrome c oxidase gene (COX1) was amplified from the beef extract ( Panel B). Data generated by Terra qPCR Direct TB Green Premix corresponded to the theoretical quantities of each gene, while the conventional product was clearly affected by inhibitors present in the crude samples.
Real-time PCR of GC-rich targets—Terra qPCR Direct TB Green Premix versus conventional 2X qPCR premixes. Targets with GC-content greater than 70% were amplified by real-time PCR using either human testis cDNA (equivalent to 50 ng–5 pg of total RNA; Panel A) or human genomic DNA (100 ng–10 pg; Panel B) as template, and either Terra qPCR Direct TB Green Premix (triangles) or one of two conventional SYBR premixes (one specifically for GC-rich targets; see figure legend). Using the manufacturer’s recommended conditions for each enzyme mix, gene-specific primers were used to amplify portions of the jun-D proto-oncogene (JUND), the BTB domain-containing protein 6 gene (BTBD6), and the cyclin I gene (CCNI) from the cDNA (Panel A); and a portion of the beta-actin CpG island (ACTB_CpG) from the genomic DNA (Panel B). The resulting Ct values were plotted against the initial quantity of DNA used in each assay. Terra qPCR Direct TB Green Premix was the only premix able to consistently amplify all of the targets assayed.
TB Green Advantage qPCR Premix
2x zatężony premiks do qPCR z wykorzystaniem barwnika interkalującego (SYBR = TB Green). Zawiera pełnej długości polimerazę Taq zabezpieczoną przeciwciałem przed niespecyficzną amplifikacją (Hot Start). Produkt zapewnia doskonałą czułość, efektywność amplifikacji oraz szeroki zakres dynamiczny.
Amplikony są generowane bardzo szybko (30 sek).
W skład kitu wchodzą barwniki kontrolne ROX LSR i LMP (kiedy źródłem fali jest laser lub lampa).
Comparison of amplification efficiency. Takara Bio TB Green Advantage qPCR Premix outperforms Competitor A’s SYBR mix on an ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. The results for the Takara Bio reagent are shown in Panels A and C, and those for Competitor A’s reagent are shown in Panels B and D. The TB Green Advantage premix showed higher amplification efficiency, indicated by Ct values shifted to the left.
Strona produktu-> TB Green Advantage qPCR premixes (takarabio.com)
Premix Ex Taq (Perfect Real Time)
Czy zastanawiałeś się kiedyś co się dzieje z RNA po reakcji odwrotnej transkrypcji?
Zazwyczaj nie wspomina się o nim zbyt często a niestety jego pozostałości mogą wpływać negatywnie na odczyt wyników qPCR. W zależności jak bardzo RNA zdegraduje podczas cykli termicznych może blokować dostęp do cDNA tworząc z nim hybrydy RNA-DNA lub sam stanowić matrycę dla primerów. Oba efekty wpływają na końcowy odczyt i powodują powstawanie artefaktów a w konsekwencji niepowtarzalnych lub słabych statystycznie wyników.
Niektórzy, świadomi opisanego zjawiska dodają do próbki RNazy, co jednak przedłuża cały protokół. Rozwiązaniem może być Premiks Ex Taq (Perfect Real Time), który posiada w swoim składzie Tli RNazę H. Enzym trawi pozostałości RNA zalegające w próbce po przepisaniu, ale w sposób dużo szybszy, przez co nie wydłuża protokołu. Usunięcie RNA z materiału sprawia, że gromadzone wyniki są bardziej powtarzalne, przez co nie trzeba wykonywać wielu eksperymentów aby uzbierać zadowalające wyniki do puli.
Ponad to sam premiks jest bardzo czuły. Pozwala na wykrycie już 100 kopii matrycy. Wszystko dzięki użytemu blendowi polimeraz Ex Taq – polimerazy Takara Taq (enzymu pełnej długości) i polimerazy proofreading. To rzadkość wśród takich miksów.
Obecność polimerazy proofreading w reakcji znacząco wpływa jej wydajność. Wierniej odtworzona matryca to lepsze oddziaływanie z primerami i efektywność reakcji bardziej zbliżona do 100% (za modelem 2-ΔΔCt ). Warto zauważyć, że spadek tej efektywności zaledwie o 10% powoduje uzyskanie jedynie 20% produktu. To znaczące straty zwłaszcza dla metody ilościowej. Zaopatrzenie polimerazy w Hot Start z kolei pozwala na uniknięcie niechcianej amplifikacji.
Dostępne są dwa formaty produktu z barwnikiem interkalującym (SYBR= TB Green), do matryc standardowej długości w technice real time (<300 bp) oraz do dłuższych (<570 bp). Są to odpowiednio TB Green Ex Taq (RR820A) i TB Green Ex Taq II (RR420A).
Dostępny jest również premiks działający z sondami (RR390A).
Premiks jest wygodnie pakowany po 1 lub 5 ml w 2x zatężeniu. Może być przechowywany przez 6 miesięcy w lodówce co skraca czas przygotowywania reakcji, ponieważ nie trzeba go rozmrażać.
Strona produktu
- TB Green Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) RR420 (takarabio.com)
- TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNase H Plus) RR820 (takarabio.com)
Zobacz MasterMiksy w akcji
– Accurate gene expression analysis with TB Green Premix Ex Taq II (takarabio.com)
– qPCR without optimization using TB Green Premix Ex Taq (takarabio.com)
– Specific, consistent real-time PCR with TB Green Premix Ex Taq II (takarabio.com)
-> Premix Ex Taq Master Mix for Probe-based Real-Time PCR (takarabio.com)
TB Green Premix DimerEraser
To premiks możliwiający pracę z primerami potencjalnie mogącymi tworzyć struktury primer-dimer. Czasami niestety nie udaje się zaprojektować książkowych primerów i konieczna jest praca z nie idealnymi np. mającymi tendencję do oddziaływań między sobą. Premiks DimerEraser dzięki specjalnej formulacji blokuje niespecyficzna amplifikację i powstawanie struktur primer-dimer. Zawiera polimerazę z Hot Start Ex Taq- będącą specjalnym blendem zawierający enzym z aktywnością proofreading. Dzięki temu reakcja PCR w miarę trwania nie traci na specyficzności. 2x zatężony premiks dostarczany z barwnikiem TB Green (= SYBR).
Probe qPCR Mix, with UNG
Miks do qPCR przeznaczony do pracy z sondami. Zawiera polimerazę z hot startem, dzięki czemu reakcję można wygodnie składać nie na lodzie i nie generowane są niespecyficzne produkty. Dodatkowo miks zaopatrzony jest w miks nukleotydów z uracylem oraz UNG, czyli uracylo N- glikozylazę. Jeśli w mieszaninie reakcyjnej w skutek zanieczyszczeń znajdą się wcześniej wygenerowane amplikony zawierające w składzie uracyl enzym je rozkłada. Zabezpieczenie reakcji takim enzymem chroni przed generacją niespecyficznych wyników i przed tzw. ”carry-over”.
Miks jest wygodnie 2x zatężony i świetnie nadaje się do pracy z cDNA, dzięki zawartości Tli RNazy H. W mieszaninie reakcyjnej po przepisaniu RNA na cDNA, ten pierwszy pozostaje w mieszaninie i degraduje w skutek termicznej lizy. Jego fragmenty mogą blokować dostęp do cDNA tworząc z nim hybrydy RNA-DNA lub same stanowić matrycę dla primerów. Oba efekty wpływają na końcowy odczyt i powodują powstawanie artefaktów a w konsekwencji niepowtarzalnych lub słabych statystycznie wyników. Usunięcie RNA z próbki sprawia, że gromadzone wyniki są bardziej powtarzalne, przez co nie trzeba wykonywać wielu eksperymentów, aby uzbierać zadowalające wyniki do puli.
Strona produktu -> Probe qPCR Mix, with UNG (takarabio.com)
