Barwienie wielokrotne

10 Grudnia 2019 (Ostatnia aktualizacja 02.10.2024)

Wybór przeciwciał do jednoczesnego wykrywania więcej niż jednego antygenu zależy przynajmniej od dwóch ważnych kryteriów:

* dostępności przeciwciał wtórnych, które nie rozpoznają a) siebie nawzajem (powinny pochodzić z tego samego gospodarza), b) innych przeciwciał pierwotnych użytych w badaniu, c) immunoglobulin pochodzących z innego gatunku występujących w układzie badanym lub d) endogennych immunoglobulin obecnych w tkankach lub komórkach badanych

* użycie odpowiedniej sondy (produkty reakcji enzymatycznej, fluorofory lub cząsteczki o dużej gęstości elektronowej)

Przeciwciała oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa oznaczone symbolem „ML” (znakowanie wielokrotne) zostały specjalnie przygotowane, tak by spełniać powyższe kryteria. Jeden z wielu możliwych protokołów znakowania przy użyciu takich odczynników został przedstawiony poniżej.

  • Antygen A tkanki mysiej
    Krok 1: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej 
    Krok 2: p. kozie anty-antygen A 
    Krok 3: sonda 1 skoniugowana z oślim anty-kozim IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)

  • Antygen B tkanki mysiej
    Krok 4: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej (jeśli jest potrzebne)
    Krok 5: p. królicze anty-antygen B 
    Krok 6: sonda 2 skoniugowana z oślim anty- króliczym IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)

  • Antygen C tkanki mysiej
    Krok 7: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej (jeśli jest potrzebne)
    Krok 8: p. szczurze anty-antygen C 
    Krok 9: sonda 3 skoniugowana z oślim anty- szczurzym IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Shp Sr Prot)

Uwaga: po każdym kroku dokładnie przepłukać, włącznie z krokiem 1. Przy mocnym i trwałym tle dalsze blokowanie może być wymagane w kroku 4 i 7. Nie rozcieńczać przeciwciał surowicą normalną, ani nie mieszać przeciwciał ze sobą.

W przykładzie tym, przeciwciała użyte w kroku 3, 6 i 9 nie rozpoznają się wzajemnie ponieważ pochodzą z tego samego gospodarza. Zostały również poddane adsorpcji, dlatego nie rozpoznają innych przeciwciał pierwotnych użytych w kroku 2, 5 i 8. Nie reagują także z endogennymi Ig, które mogą być obecne w tkance mysiej.

Przykładowe barwienia:

Przekrój pionowy skóry ludzkiej pobranej z uda

Komórki Langerhansa (Cy2, zielony), błony podstawowe (Cy3, czerwony), komórki tuczne (Cy5, niebieski).

Zdjęcie wykonane przez Dr. William R. Kennedy i Dr. Gwen Wendelschafer-Crabb, Department of Neurology, University of Minnesota.


Błona śluzowa żołądka

Kolagen typu IV (Alexa Fluor 488, zielony), PGP 9.5 (DyLight 649, czerwony)
Zdjęcie wykonane przez Dr. Gwen Wendelschafer-Crabb, Kennedy Lab,
University of Minnesota.

To może Cię zainteresować...

EPOCH 2 - starszy brat o większych możliwościach
EPOCH 2 - starszy brat o większych możliwościach

EPOCH 2 - starszy brat o większych możliwościach

Spektrofotometry mikropłytkowe, czyli czytniki płytek do pomiaru absorbancji oparte o monochromator, na stałe zadomowiły się w polskich laboratoriach. Mimo, że czytniki filtrowe, takie jak 800 TS, wciąż znajdują swoich odbiorców, to dla większości Użytkowników spektrofotometr będzie bardziej uniwersalnym wyborem.

LogPhase – czytnik dla mikrobiologa
LogPhase – czytnik dla mikrobiologa

LogPhase – czytnik dla mikrobiologa

Wykorzystanie mikroorganizmów leży u podstaw przemysłu biotechnologicznego. Niezależnie od tego czy mowa jest o produkcji żywności, leków, alternatywnych tworzyw syntetycznych czy biopaliw, to niezbędne jest badanie tempa i charakterystyki wzrostu drobnoustrojów.

CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA
CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA

CRISPR/Cas9 – historia, zastosowania i nowe metody syntezy ssDNA

Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna zostały w 2020 roku uhonorowane Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii za rozwój metody CRISPR/Cas9, nazywanej potocznie precyzyjnymi nożyczkami genetycznymi. Należy jednak pamiętać, że zainteresowanie wielu badaczy oraz jednostek naukowych na całym Świecie tym niezwykle precyzyjny narzędziem do edycji genów sięga późnych lat 80 tych XX wieku.

Zobacz wszystkie