Barwienie wielokrotne

Wybór przeciwciał do jednoczesnego wykrywania więcej niż jednego antygenu zależy przynajmniej od dwóch ważnych kryteriów:

* dostępności przeciwciał wtórnych, które nie rozpoznają a) siebie nawzajem (powinny pochodzić z tego samego gospodarza), b) innych przeciwciał pierwotnych użytych w badaniu, c) immunoglobulin pochodzących z innego gatunku występujących w układzie badanym lub d) endogennych immunoglobulin obecnych w tkankach lub komórkach badanych

* użycie odpowiedniej sondy (produkty reakcji enzymatycznej, fluorofory lub cząsteczki o dużej gęstości elektronowej)

Przeciwciała oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa oznaczone symbolem „ML” (znakowanie wielokrotne) zostały specjalnie przygotowane, tak by spełniać powyższe kryteria. Jeden z wielu możliwych protokołów znakowania przy użyciu takich odczynników został przedstawiony poniżej.

• Antygen A tkanki mysiej
  Krok 1: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej 
  Krok 2: p. kozie anty-antygen A 
  Krok 3: sonda 1 skoniugowana z oślim anty-kozim IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)
  
  
• Antygen B tkanki mysiej
  Krok 4: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej (jeśli jest potrzebne)
  Krok 5: p. królicze anty-antygen B 
  Krok 6: sonda 2 skoniugowana z oślim anty- króliczym IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)
  
  
• Antygen C tkanki mysiej
  Krok 7: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej (jeśli jest potrzebne)
  Krok 8: p. szczurze anty-antygen C 
  Krok 9: sonda 3 skoniugowana z oślim anty- szczurzym IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Shp Sr Prot)

Uwaga: po każdym kroku dokładnie przepłukać, włącznie z krokiem 1. Przy mocnym i trwałym tle dalsze blokowanie może być wymagane w kroku 4 i 7. Nie rozcieńczać przeciwciał surowicą normalną, ani nie mieszać przeciwciał ze sobą.

W przykładzie tym, przeciwciała użyte w kroku 3, 6 i 9 nie rozpoznają się wzajemnie ponieważ pochodzą z tego samego gospodarza. Zostały również poddane adsorpcji, dlatego nie rozpoznają innych przeciwciał pierwotnych użytych w kroku 2, 5 i 8. Nie reagują także z endogennymi Ig, które mogą być obecne w tkance mysiej.

Przykładowe barwienia:

Przekrój pionowy skóry ludzkiej pobranej z uda

Komórki Langerhansa (Cy2, zielony), błony podstawowe (Cy3, czerwony), komórki tuczne (Cy5, niebieski).

Zdjęcie wykonane przez Dr. William R. Kennedy i Dr. Gwen Wendelschafer-Crabb, Department of Neurology, University of Minnesota.

Błona śluzowa żołądka
Kolagen typu IV (Alexa Fluor 488, zielony), PGP 9.5 (DyLight 649, czerwony)
Zdjęcie wykonane przez Dr. Gwen Wendelschafer-Crabb, Kennedy Lab,
University of Minnesota.