Barwienie wielokrotne

10 Grudnia 2019 (Ostatnia aktualizacja 02.10.2024)

Wybór przeciwciał do jednoczesnego wykrywania więcej niż jednego antygenu zależy przynajmniej od dwóch ważnych kryteriów:

* dostępności przeciwciał wtórnych, które nie rozpoznają a) siebie nawzajem (powinny pochodzić z tego samego gospodarza), b) innych przeciwciał pierwotnych użytych w badaniu, c) immunoglobulin pochodzących z innego gatunku występujących w układzie badanym lub d) endogennych immunoglobulin obecnych w tkankach lub komórkach badanych

* użycie odpowiedniej sondy (produkty reakcji enzymatycznej, fluorofory lub cząsteczki o dużej gęstości elektronowej)

Przeciwciała oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa oznaczone symbolem „ML” (znakowanie wielokrotne) zostały specjalnie przygotowane, tak by spełniać powyższe kryteria. Jeden z wielu możliwych protokołów znakowania przy użyciu takich odczynników został przedstawiony poniżej.

  • Antygen A tkanki mysiej
    Krok 1: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej 
    Krok 2: p. kozie anty-antygen A 
    Krok 3: sonda 1 skoniugowana z oślim anty-kozim IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)

  • Antygen B tkanki mysiej
    Krok 4: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej (jeśli jest potrzebne)
    Krok 5: p. królicze anty-antygen B 
    Krok 6: sonda 2 skoniugowana z oślim anty- króliczym IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)

  • Antygen C tkanki mysiej
    Krok 7: blokowanie przy użyciu 5% normalnej surowicy oślej (jeśli jest potrzebne)
    Krok 8: p. szczurze anty-antygen C 
    Krok 9: sonda 3 skoniugowana z oślim anty- szczurzym IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Shp Sr Prot)

Uwaga: po każdym kroku dokładnie przepłukać, włącznie z krokiem 1. Przy mocnym i trwałym tle dalsze blokowanie może być wymagane w kroku 4 i 7. Nie rozcieńczać przeciwciał surowicą normalną, ani nie mieszać przeciwciał ze sobą.

W przykładzie tym, przeciwciała użyte w kroku 3, 6 i 9 nie rozpoznają się wzajemnie ponieważ pochodzą z tego samego gospodarza. Zostały również poddane adsorpcji, dlatego nie rozpoznają innych przeciwciał pierwotnych użytych w kroku 2, 5 i 8. Nie reagują także z endogennymi Ig, które mogą być obecne w tkance mysiej.

Przykładowe barwienia:

Przekrój pionowy skóry ludzkiej pobranej z uda

Komórki Langerhansa (Cy2, zielony), błony podstawowe (Cy3, czerwony), komórki tuczne (Cy5, niebieski).

Zdjęcie wykonane przez Dr. William R. Kennedy i Dr. Gwen Wendelschafer-Crabb, Department of Neurology, University of Minnesota.


Błona śluzowa żołądka

Kolagen typu IV (Alexa Fluor 488, zielony), PGP 9.5 (DyLight 649, czerwony)
Zdjęcie wykonane przez Dr. Gwen Wendelschafer-Crabb, Kennedy Lab,
University of Minnesota.

To może Cię zainteresować...

Leki biopodobne
Leki biopodobne

Leki biopodobne

Leki biopodobne – czym są i jakie mają znaczenie we współczesnej farmakoterapii? Leki biopodobne (biosimilars) to preparaty opracowane jako odpowiedniki referencyjnych leków biologicznych, których patenty już wygasły.

Złap wielkanocną promocję!
Złap wielkanocną promocję!

Złap wielkanocną promocję!

Wielkanocna promocja SERVA – wykorzystaj wyjątkową okazję! Wraz z nadejściem wiosny startujemy z promocją, która obejmuje szeroki wybór produktów marki SERVA. Od Wielkanocy aż do 30 czerwca 2025 r. wszystkie gramatury wybranych odczynników dostępne będą w specjalnych, obniżonych cenach.

Sitka EASYstrainer™ Greiner Bio-One
Sitka EASYstrainer™ Greiner Bio-One

    Sitka EASYstrainer™ Greiner Bio-One

    Sitka EASYstrainer™ marki Greiner Bio-One zaprojektowano do szybkiej i bezpiecznej filtracji zawiesiny komórkowej, np. do przygotowania homogenicznego preparatu pojedynczych komórek do cytometrii przepływowej, czy do filtracji izolatów komórek pierwotnych.

    Zobacz wszystkie